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      Cisbio HTRF技术磷酸化检测整体解决方案

      来源:作者:人气:-发表时间:2019-06-26 13:28:00【
      磷酸化和去磷酸化是细胞中酶的化学修饰调节中最常见,也是最重要的。很多酶需要磷酸化后才有活性,然后再进一步使它的下游磷酸化。Cisbio Bioassays 提供一系列HTRF磷酸化蛋白测量试剂,可以直接检测细胞裂解液或完整细胞中的磷酸化蛋白的含量。该方法操作简单、稳定可靠、灵敏度高,并且可以用很小体积的微孔板进行实验,非常适合高通量筛选。HTRF 技术可用来进行第二信使检测、胞内信号分子检测和受体配体结合检测方案,从而从全方位帮助您进行G蛋白偶联受体的研究。
      西宝生物提供的HTRF技术磷酸化检测试剂盒和相关激酶,品种齐全,质量保证。订购热线:400-021-8158
      HTRF磷酸化检测原理:
      实验可在细胞裂解液或者完整细胞中进行。当受体被刺激后,引发了相关激酶的活化,导致下游蛋白被磷酸化。细胞膜裂解之后,磷酸化的蛋白释放出来,被HTRF试剂检测到。磷酸化蛋白的测量应用了双抗体夹心法,两个抗体均为单克隆抗体。其中一个为抗磷酸化蛋白的抗体,标记Eu;另一个为抗蛋白其它位点的抗体,标记d2,见图1。这些抗体可以预先混合后,通过一次加样来完成。所有的实验均可通过两步法或者一步法实现。
      图1:HTRF磷酸化蛋白测量的实验过程
      一步法:
      细胞铺板,化合物刺激,细胞裂解和磷酸化蛋白检测均在同一个板孔中,不需要洗涤过程。此方法更加适用于高通量筛选,并且在不影响HTRF优越性的前提下减少了试剂用量。
      两步法:
      细胞置于培养板中,化合物刺激后裂解细胞。将裂解液转移到检测板中,加入HTRF检测试剂检测磷酸化蛋白该方法可以观察细胞的存活和生长情况。
      目前已经上市的HTRF磷酸化检测试剂盒有:

      pERK

      pP38

      pSTAT3

      pAKT

      pATF2

      pSTAT5

      pBAD

      pS6RP/pMEK1

      pSTAT6

      下面我们重点来看一下这款pERK磷酸化检测试剂盒
      Cellul´erk 胞外调节蛋白激酶磷酸化检测试剂盒 --- 直接测量细胞水平实验中磷酸化ERK1/2的含量
      ERK1/2是许多信号传导通路的会聚点,所以可以用磷酸化ERK含量的变化来反应G蛋白偶联受体是否被活化或者抑制。
      磷酸化ERK1/2检测是基于双抗体夹心法的原理。在试剂盒中含有两个抗体,一个抗体是抗磷酸化ERK1/2的抗体,标记d2;另一个抗体是抗ERK1/2其它位点的抗体,标记Eu。
      检测原理:
      受体受到刺激,ERK1/2被磷酸化。在细胞膜裂解之后,磷酸化的ERK1/2释放出来,通过基于HTRF技术的双抗体夹心法被检测到。其中
      试剂盒应用HTRF技术,不需要洗涤,比Western Blot、 ELISA和其它基于微珠测试的方法更加简单快速。

      磷酸化检测原理图

      HTRF磷酸化检测案例:
      案例一:Gαq/i偶联的受体活化
      Rantes 和 MIP-Ib在室温条件下刺激CCR5受体(CHO,25,000细胞/孔),时间为10分钟,用HTRF Cellul´ERK 试剂盒来测试磷酸化ERK1/2水平。EC50分别为2.8 nM和18.8 nM,与文献报道一致。

      CHO-CCR5中ERK1/2的磷酸化水平
      案例二:用Cellul´erk进行筛选具有很好的稳定性
      用Carbachol (卡巴胆碱)在室温刺激CHO-M1细胞,时间为10分钟(5,000细胞/孔,384浅孔板),结果如下图
      选择未刺激的细胞、1.3 μM Carbochol和4 μM Carbochol计算Z´值,分别对应实验的基础水平、EC80和EC100,每种条件50个重复,实验采用一步法。两个条件的Z´值均大于0.7,表明实验非常稳定,可用于高通量筛选。

      案例三:MAPK信号通路的活化
      用PMA刺激CHO-M1细胞(50,000细胞/孔),时间为10分钟,结果如图
      PMA是PKC的直接激活剂。该实验得到的EC50为9.6 nM,检测窗口为4.5。

      PMA刺激的CHO-M1细胞中ERK1/2的磷酸化水平
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      ERK phospho-T202/Y204 kit
      500tests
      64ERKPEG
      Cisbio
      2-8°C
      10,000tests
      64ERKPEH
      Cisbio
      2-8°C
      ERK phospho-T202/Y204 kit
      control lysate
      kit
      62ERKTDA
      Cisbio
      2-8°C
      Advanced ERK phospho-
      T202 /Y204 kit
      500tests
      64AERPEG
      Cisbio
      -60℃以下
      1x96tests
      64AERPET
      Cisbio
      -60°C以下
      10,000tests
      64AERPEH
      Cisbio
      -60℃以下
      Advanced ERK phospho-
      T202 /Y204 kit control lysate
      kit
      64AERTDA
      Cisbio
      2-8°C
      Phospho and Total protein blocking reagent
      2ml
      64KB1AAC
      Cisbio
      2-8°C
      6ml
      64KB1AAD
      Cisbio
      2-8°C
      Phospho-Total protein lysis buffer
      130ml
      64KL1FDF
      Cisbio
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